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龙图腾网获悉中国农业大学申请的专利一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116183788B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-05-08发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202310024452.2，技术领域涉及：G01N30/06；该发明授权一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法是由马玲君;余漪燃;李伟;牟瑶;季俊夫;陈芳;胡小松设计研发完成，并于2023-01-09向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法在说明书摘要公布了：本发明属于生物分析领域，提供了一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法。通过优化质谱参数和液相色谱方法，实现了在6min内一次进样，并且对11种涉及TCA循环途径代谢的生物标志物进行高通量、高灵敏、高分离度的检测。同时，本发明创新性的使用了LC‑MSMS来破译13C通过糖酵解和TCA循环从葡萄糖到后续代谢物的逐步位置特异性转移，从而计算13C从顺序前体到其产物的位置特异性转移的关键代谢率丙酮酸脱氢酶、β‑氧化、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶和丙酮酸循环的综合稳态分析。这项技术具有广泛的适用性，可以潜在地表征任何组织或细胞的线粒体代谢。

本发明授权一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法在权利要求书中公布了：1.一种基于同位素示踪技术结合高分辨质谱的精准代谢流分析TCA循环的方法，其特征在于，包括如下步骤： S1：细胞培养：在细胞饥饿1～4h后，用第一培养基培养细胞1～6h达到细胞代谢稳态，再使用带有同位素13C的第二培养基标记细胞1～6h达到细胞同位素稳态；若细胞为肝细胞，则生糖底物为1～20mM乳酸和1～20mM丙酮酸，若细胞为胰岛细胞，则生糖底物为1～20mM葡萄糖和1～20mM谷氨酰胺，pH调至6.8～7.8； S2：液质样品制备：用50～200μL细胞猝灭剂收集细胞并冻干，然后用20～100μL孔的复溶剂复溶冻干细胞，并离心取上清液制得液质样品； S3：采用液质联用仪进行液质分析； S4：液质分析数据处理； S41：自然丰度校正； S42：柠檬酸的去卷积； S43：异柠檬酸脱氢酶的校正； S44：通过质量同位素分布分析测定乙酰辅酶A和草酰乙酸的含量； S45：基于同位素稳态的代谢流速率比计算； S42中所述液质分析数据处理中的子离子碎片信息由母离子切去柠檬酸Cit的C1、C6或者C5、C6得到子离子，由于这两个碳原子包含了来自丙酮酸脱羧酶通路与丙酮酸脱氢酶通路的信息，通过对所有子离子碎片进行去卷积分析，得到柠檬酸族：Cita、Citb、Citc、Citd、Cite、Citf、Citg、Cith、Citi、Citj的代谢流信息，其计算公式如下： Cita＝3*19369-19368 Citb＝2*19368-19369 Citc＝3*19469-5*19468-5*19470 Citd＝4*19468-4*19469+12*19470 Cite＝2*19468-2*19469-6*19470 Citf＝2*19570+2*19569 Citg＝9*19569-19570 Citj＝19771； S43中所述异柠檬酸脱氢酶的校正，通过[4,5-13C2]柠檬酸与[1,2-13C2]乙酰辅酶A之比去校正异柠檬酸脱氢酶反应逆流导致的标记碳回流现象，使S42中柠檬酸去卷积的结果更加准确，其计算公式如下： 19570c＝19570*196701-ΦAcCit+195691-ΦAcCit 19470c＝19470-195691-ΦAcCit 19469c＝19469-195691-ΦAcCit+194681-ΦAcCit 19369c＝19369-194681-ΦAcCit 19368c＝19368-194681-ΦAcCit+19368-193691-ΦAcCit；S44中通过柠檬酸质量同位素分布分析测定乙酰辅酶A和草酰乙酸的含量，其计算公式为： [1,2-13C2]AcCOA的计算方法如下： 13C标记的OAA计算方程式如下： 所述S41中所述自然丰度校正通过将测量出的13C进行自然丰度的校正以除去自然界中13C的影响，从而得到实验中添加的13C丰度，其计算公式如下： I′Pm,Dn＝IPm,Dn*1+Kp-m-IPm-1,Dn*kp-d-m-n-1-IPm-1,Dn-1*kd-n-1 p：母离子中的碳总数； d：子离子中的碳总数； m：母离子中13C的数目； n：子离子中13C的数目； I：对应于母离子P从0→p和子离子D从0→d的峰面积； k＝0.11，自然界中13C的自然丰度； m-v≤p-d。

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